一、概述
共聚焦显微镜不同于普通荧光显微镜，它利用针孔的物理限制，仅允许来自焦平面的光聚焦进入探测器，而将焦平面上方和下方的模糊荧光信号(离焦光)阻挡在外。这带来了显著的优势：
光学切片能力： 获得样品内部特定深度、薄层(通常在0.5 - 2微米)的高分辨率图像。
更高的分辨率： 主要是在轴向(Z方向，沿光轴方向)分辨率显著提高。
背景抑制： 大幅减少来自非焦平面的背景噪音，提升图像的对比度和清晰度。
三维重建： 通过对样品不同深度进行连续扫描，可重建三维结构。
点扫描成像： 图像是通过逐点扫描激光束并逐点采集信号形成的，速度通常比宽场荧光显微镜慢。
二、关键组件
1.激光光源： 提供高强度、单色性好、方向性好的激发光。通常配备多个不同波长的激光器，用于激发不同的荧光染料。
2.扫描装置：
扫描振镜： 核心部件，通常是两个高速振动的反射镜(X轴和Y轴)，精确控制激光束在样本表面的扫描路径。
扫描透镜与管透镜： 确保扫描光束精确聚焦在物镜的后焦面，实现无畸变扫描。
3.分光镜/二向色镜： 将激发光反射到样本方向，同时允许样本发射的荧光透射到探测光路。需要根据所用荧光染料的激发和发射光谱选择合适的镜片。
4.物镜： 高质量、高数值孔径(NA)的物镜至关重要，它决定了系统的分辨率、光收集效率和成像深度。
5.共轭针孔：
照明针孔： 位于光源后，将激光变成点光源。
探测针孔： 位于探测器前，阻挡离焦光。针孔大小可调，是控制光学切片厚度和图像信噪比的关键参数(小针孔切片薄、分辨率高但信号弱；大针孔切片厚、信号强但分辨率降低)。
6.探测器： 通常是高灵敏度的光电倍增管或雪崩光电二极管，将微弱的光信号转换为电信号。
7.计算机控制系统： 控制扫描、Z轴移动、激光强度、针孔大小、探测器增益、图像采集和处理等所有参数。
8.荧光滤光片组： 位于探测光路中，进一步阻挡残留的激发光和其他波长的杂散光，确保探测到的是特定发射波长的纯净荧光信号(发射滤光片)。
三、主要优势
1.高轴向分辨率(Z分辨率)与光学切片能力： 这是突出的优势。能清晰区分样本中不同深度的结构，获得样本内部不同层面的清晰图像，无需物理切片即可进行三维成像。
2.高对比度： 有效抑制离焦背景光干扰，显著提高图像的清晰度和信噪比，特别适合观察厚样本或弱荧光信号。
3.高分辨率： 相比传统宽场荧光显微镜，共聚焦显微镜的X-Y平面分辨率也有一定提升(约1.4倍)，尤其在利用某些技术后分辨率可接近光学衍射极限。
4.三维重建： 可对活体或固定样本进行非侵入性的三维结构解析。
5.多通道成像： 可同时或依次使用不同波长的激光激发不同的荧光标记物，实现多色标记样本的多通道成像，研究不同分子或结构的共定位。
6.活细胞成像： 减少光毒性和光漂白(相对于宽场需要更短的曝光时间获取清晰图像)，结合合适的培养系统，可用于长时间观察活细胞内的动态过程。
7.图像后处理： 强大的软件支持进行三维可视化、表面渲染、体积测量、共定位分析、荧光强度定量分析等。
四、主要应用领域
1.细胞生物学：
细胞器结构与动态(线粒体、内质网、高尔基体、细胞骨架)。
细胞膜结构与流动性。
细胞内离子浓度(如Ca²⁺, pH)成像。
基因表达与蛋白定位。
细胞间相互作用(如免疫突触)。
细胞迁移与分裂。
2.神经科学：
神经元形态与树突棘结构。
神经网络连接。
突触结构与功能。
神经递质释放与受体分布。
3.发育生物学： 胚胎发育过程的三维形态发生、基因表达模式。
4.病理学与临床诊断：
组织病理学切片分析(提供比普通光镜更丰富的亚细胞信息)。
皮肤科在体共聚焦显微镜用于无创诊断皮肤病(如黑色素瘤)。
5.免疫学： 免疫细胞激活、迁移、与靶细胞的相互作用。
6.微生物学： 细菌、真菌在宿主细胞内的生存、生物膜结构。
7.植物学： 植物细胞结构、细胞壁、叶绿体、基因表达。
8.材料科学： 材料表面形貌、涂层厚度、薄膜结构、微电子器件检测、高分子材料结构等(常使用反射模式)。
五、关键注意事项与实践
1.降低光毒性/光漂白： 这是活细胞成像的首要原则！
最小激发强度： 使用低有效激光功率。
最小有效曝光时间： 使用最快扫描速度或减少平均次数。仅在必要时才使用慢扫描和高平均。
缩短总曝光时间： 避免在感兴趣区域进行不必要的预扫描和寻找焦点操作。尽快找到位置聚焦完成拍摄。
使用尽可能低的增益。
使用高量子效率探测器，降低激发光需求。
使用抗淬灭试剂(仅限固定样品，活样品可能无效或有害)。
2.针孔调整：
并非针孔越小越好。过小的针孔会严重损失信号。
只有在需要最高分辨率或研究较薄样品结构时，才考虑缩小针孔。
如果样品很厚信号很弱或不需要超薄切片时，可以适当增大针孔以获得足够信噪比。
3.选择合适的物镜：
数值孔径(NA)是分辨率的关键！ 优先选择高NA物镜。
浸没介质选择：油镜分辨率最高，适用于盖玻片固定的薄样品；水镜适用于活细胞长时间成像(避免折射率不匹配引起的球差)；硅油或甘油镜适用于深组织成像。
放大倍数与视野、分辨率相匹配。
4.实验设计：
选择合适的荧光染料/蛋白，确保激发波长与激光匹配，发射波段范围与检测通道匹配。注意荧光串扰。
预实验很重要：在不同条件下测试多种参数组合，找到最佳设置。
5.仪器维护与安全：
严格遵守激光安全规程：绝对不要直视激光束！
保持显微镜平台稳定无震动。
保持环境清洁(灰尘是光学系统大敌)。
定期(按规程)由专业工程师进行系统校准(如激光准直、针孔校准、PMT校准)。
